Bio science study, 1) CRISPR-cas9, cas12

Cas9: 오리지널 CRISPR 효소

현재까지 가장 잘 알려진 Cas 단백질은 최초의 유전자 편집 효소인 SpCas9입니다. Cas9는 원래 침입하는 외래 DNA를 절단하도록 진화한 여러 종류의 박테리아에서 발견됩니다. 2005년 Alexander Bolotin은 새로 서열이 밝혀진 박테리아인 Streptococcus thermophilus 7을 연구하면서 특이한 CRISPR 유전자좌를 발견했습니다 . CRISPR 어레이(보존 반복 및 스페이서 교대)는 이전에 보고된 시스템과 유사했지만 알려진 cas 유전자 중 일부가 부족하고 대신 새로운 cas 유전자를 포함했습니다. 

이러한 새로운 cas 유전자 중 하나는 뉴클레아제 활성을 가질 것으로 예상되는 큰 단백질인 Cas9를 암호화했습니다. Bolotin은 또한 바이러스 유전자와 상동성을 갖는 스페이서가 모두 한쪽 끝에서 공통 서열을 공유한다고 지적했습니다. 원하는 절단 부위 옆에 위치한 이 표적 DNA 조각을 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)라고 하며 표적 인식에 필요합니다. 박테리아 면역에 대한 Bolotin의 연구는 궁극적으로 Jennifer Doudna와 그녀의 팀에 의해 Cas9가 실제로 RNA 유도 엔도뉴클레아제라는 획기적인 발견으로 이어졌습니다 14 . 이 발견을 바탕으로 Doundna와 동료들은 "유전자 표적화 및 게놈 편집 응용 분야에 상당한 잠재력을 제공할 수 있는 RNA 프로그래밍 Cas9에 기반한 대체 방법론"을 제안했습니다 14 .

 

Cas12: CRISPR-Dx의 미래?

2015 년에 박테리아에서 발견된 Cas12는 CRISPR 제품군에 최근 추가된 것입니다. 그러나 지난 몇 년 동안 Cas12는 진단에서의 잠재적인 사용에 대해 점점 더 많은 관심을 모았습니다 16 . 표적을 인식하고 절단하는 데 두 개의 RNA가 필요하고 고유한 RNAse 활성이 없는 Cas9와 달리 Cas12는 자체 가이드 RNA(단일 RNA 유도 엔도뉴클레아제)를 처리하고 표적화를 위해 crRNA만 필요합니다. 

Arbor Biotechnologies의 David Scott과 동료들은 Eugene Koonin과 협력하여 최근 전체 Cas12 제품군을 연구하여 새로운 기능을 갖춘 이펙터를 찾았습니다 17. 그들은 함께 V형 시스템에 대한 거의 300,000개의 추정 CRISPR–Cas 요소 데이터베이스를 구축하고 검색했습니다. 그런 다음 그들은 V형 계통수에 세 가지 주요 가지가 있다는 것을 발견했습니다. 하나는 Cas12a, c, d 및 e이고; Cas12b, h 및 i를 포함하는 두 번째; 세 번째는 Cas12g와 같은 더 작은 이펙터를 사용합니다. 흥미롭게도 Cas12g는 단일 가닥 DNA와 RNA를 모두 비특이적 방식으로 절단할 수 있습니다. 이 능력은 바이러스나 특정 돌연변이의 존재를 탐지하는 데 활용될 수 있습니다. 반면 Cas12i는 단일 가닥 DNA 절단을 위해 트랜스 활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)가 필요하지 않으며 가이드 RNA와 쌍을 이루지 않는 DNA의 한 가닥에만 절단을 도입할 수 있습니다. 이 때문에 Cas12i는 치료용 게놈 편집을 위한 매우 구체적인 플랫폼이 될 가능성이 있습니다.

 

Cas-9 및 Cas-12의 미래: 게놈 편집을 넘어서

2000년대 초반부터 연구자들은 CRISPR 편집의 정확성을 높이기 위해 새로운 변종을 설계하려고 노력해 왔습니다. 예를 들어 Cas9-HF1(또는 "HiFi")은 J. Keith Joung과 팀이 비특이적 접촉을 줄이기 위해 설계했으며 18, 이 Cas9 변형은 연구 및 상업용 응용 분야에 특히 유용합니다. 동시에 Cas9의 더 작은 버전이 황색 포도상구균에서 발견되어 단일 AAV(아데노 관련 바이러스) 벡터 19로 패키징될 수 있게 되었습니다. 크기가 작기 때문에 생체 내 유전자 전달 치료를 위한 잠재적으로 실행 가능한 후보가 됩니다. 최초의 CRISPR 이펙터 뉴클레아제인 Cas9는 Cas12보다 훨씬 긴 연구 역사, 출판 기록 및 더 많은 투자를 보유하고 있습니다.

흥미롭게도 Cas9와 Cas12는 서로 다른 PAM 서열을 인식합니다. Cas9에 필요한 GG 서열은 Cas12에 필요한 표준 TT보다 포유류 세포에 더 풍부합니다. 이러한 이유로 많은 연구자들은 Cas9가 포유류 시스템에서 사용하기에 더 유연하다고 생각합니다. 또한, 더 높은 특이성과 효율성으로 인해 CRISPR/Cas9는 X 연관 질환과 같은 많은 유전 질환과 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 심혈관 질환 및 신경퇴행성 질환과 같은 비유전 질환에 널리 적용되었습니다 20 . 또한, 연구자들은 유전자 치료 및 면역치료를 통해 암을 치료하거나 완화하기 위해 CRISPR/Cas9 기술을 사용하는 방법을 연구하고 있습니다(참조). 

반면, 비특이적 방식으로 단일 가닥 DNA를 절단하는 Cas12의 능력은 바이러스 및 암세포와 같은 소스에서 소량의 DNA를 감지하는 데 활용될 수 있으므로 Cas12는 DNA 진단을 ​​위한 강력한 도구가 됩니다. 오늘날 Doudna 박사와 Berkeley 팀이 개발한 것과 같은 CRISPR 테스트는 Cas 단백질의 다양한 특성을 사용하여 질병을 표적으로 삼습니다. 예를 들어 HPV 진단에서는 Cas12a를 사용합니다. 이 테스트는 자궁경부암이나 항문암과 관련이 있는 것으로 밝혀진 두 가지 유형의 HPV를 구별합니다 21 .

 

 

출처)

https://invivobiosystems.com/crispr/history-of-crispr-cas9-and-cas12/#:~:text=Contrary%20to%20Cas9%2C%20which%20requires,only%20requires%20crRNA%20for%20targeting.